大豆磷脂组分的测定

大豆磷脂是一种混合磷脂，它是由磷脂酰胆碱（卵磷脂，简称PC）、磷脂酰乙醇胺（脑磷脂，简称PE）、磷脂酰肌醇（肌醇磷脂，简称PI）、磷脂酰丝胺酸（丝胺酸磷脂，简称PS）等成分组成，其中最典型的是前三种。磷脂是人体细胞（细胞膜、核膜、质体膜）的基本成分，大豆磷脂不仅具有较强的乳化、润湿、分散作用，还在促进体内脂肪代谢、肌肉生长、神经系统发育和体内抗氧化损伤等方面发挥很重要的作用。

1、测定原理

    试样中的磷脂用氯仿—甲醇混合液提取,经氨基硅胶固相萃取柱纯化后,高效液相色谱分离,外标法定量。

2、样品制备

2.1提取

   称取5 g(精确至0. 1 mg)固体试样于50 mL具塞离心管,加入30 mL氯仿—甲醇混合溶液混匀,30℃超声波提取30 min,滤纸过滤后加入6 mL生理盐水,3 000 r/min离心15 min,待液体分层,取下层液体转移至接收瓶中,用旋转蒸发仪45℃水浴真空蒸至近干,得到脂质。

2.2净化

  用2.0 mL氯仿溶解脂质,得脂质氯仿溶液。过1 mL氯仿活化后的氨基硅胶固相萃取柱后,依次用2 mL氯仿一异丙醇混合溶液和3 mL的乙酸—乙醚混合溶液洗脱小柱,弃去洗脱液,最后用3.0 mL甲醇洗出磷脂并收集,40℃ 氮吹至近干,加入300 uL流动相溶解,4 000 r/ min离心15 min,取上清液进液相色谱仪测定。

3、色谱条件

色谱柱:Lichrosorb Si 60- 5(5 um,250 mm×4. 6 mm);

流动相:正已烷+异丙醇+1%乙酸水溶液=8+8+1，等度洗脱；柱温:30℃;进样量:10 uL;检测波长:210 nn为最大吸收波长;流速: 1 mL/ min。

4、样品测定

      分别制备不同浓度的磷脂工作标准溶液,其中磷脂酰胆碱的工作标准溶液质量浓度为50 ug/ mL,250 ug/ mL,800 ug/mL,1 000 ug/mL和4 000 ug/mL;磷脂酰乙醇胺的工作标准溶液质量浓度为100 ug/mL,250 ug/mL,800 ug/mL,1 000 ug/ mL和4 000 ug/mL;磷脂酰肌醇的工作标准溶液质量浓度为150 ug/mL、250 ug/mL,800 ug/ mL、1 000 ug/ mL和4 000 ug/mL。   待流速和柱温稳定后,准确吸取10 uL磷脂标准工作溶液注射入HPLC，在相同的色谱条件下注射10 uL测试液。测试液以峰面积定量。由色谱峰的峰面积可从标准曲线上求出相应的磷脂的浓度。

5、结果计算

   试样中磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰肌醇含量(w)以每克试料中磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰肌醇的微克数(ug/g)表示,按下式计算:w=C*V/m    式中：

    w——试样中磷脂含量,单位为微克/克(ug/g) ;    C——从标曲上得到的被测组分溶液浓度,单位为微克每毫升(ug/mL);    V——定容体积,单位为毫升(mL);    m——试样质量,单位为克(g)。