小麦籽粒蛋白组分测定

蛋白质含量与小麦品质密切相关，要深入了解决定小麦营养和加工品质的机制及其调控措施，不仅要研究蛋白质总量，还要研究蛋白质的组分。小麦籽粒蛋白质是由清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白4种蛋白组成，前两种蛋白决定其营养品质，后两种决定加工品质。

一、实验原理

  植物种子蛋白质的85 %~90 %是储藏蛋白，只要分布在胚乳或子叶中。植物种子种的蛋白质根据其溶解特性划分四中类型，即清蛋白溶于水和稀盐溶液;球蛋白不溶于水，但溶于稀盐溶液;醇溶蛋白不溶于水，但溶于70 %~80 %的乙醇中;谷蛋白不溶于水、醇中，但溶于稀酸、稀碱中。根据蛋白质组分在不同溶剂中的溶解性，可按顺序用蒸馏水、稀盐、乙醇、稀碱分别提取清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白，分别收集提取液，再用考马斯亮蓝G-250或其他方法测定各蛋白组分。

二、样本处理

  及时剥出麦穗中的籽粒，在120℃烘箱中杀青15min,再于65℃下烘至恒重,用粉碎机粉碎,过60目筛,测定蛋白质组分含量。

三、蛋白质组分提取3.1清蛋白提取

  万分之一天平准确称取样品 0.5g，置于10ml离心管中，加入蒸馏水3ml，用玻璃棒搅拌均匀，2ml蒸馏水冲洗玻璃杯，在水浴振荡器上 220rpm振荡30min，4000rpm离心15min，取上清夜移入50的容量瓶。向离心管的沉淀中加入5ml蒸馏水搅拌，再离心和振荡。同一离心管的样品重复提取3次,每次离心的上清夜都移到同一容量瓶内,最后用蒸馏水定容至50ml,待测。

3.2球蛋白提取

  向离心管中的残渣加入3ml 10%NaC1溶液搅拌均匀，再用2ml 10%NaCl溶液冲洗玻棒，振荡和离心步骤同清蛋白。最后用10%NaCl溶液定容至50ml，待测。

3.3醇溶蛋白提取

  向离心管中的残渣加入 3ml 70%CH;CHOH溶液搅拌均匀，再用2ml 70%CH:CH,OH溶液冲洗玻棒，220 rpm振荡1h，4000rpml 离心15 min，上清液移入50ml容量瓶，重复提取3次，最后用70%CH3CH2OH定容至50ml，待测。

3.4谷蛋白提取

  向离心管中的残渣加入3ml 0.2% NaOH溶液搅拌均匀，再用2ml 0.2% NaOH溶液冲洗玻棒，220 rpm振荡1h，4000rpml离心15 min，上清液移入50ml容量瓶，重复提取3次，最后用0.2%NaOH溶液定容至50ml,待测。

四、标准曲线制备4.1考马斯亮蓝 G-250

  准确称取100 mg考马斯亮蓝G-250，溶于95 %CH3CH2OH溶液中，加入85 %的（W/V）磷酸100 ml，最后用蒸馏水定容至1000 ml，过滤后于4℃冰箱保存备用。

4.2 牛血清蛋白标准液

  准确称取牛血清蛋白100 mg，均匀溶于1L蒸馏水中，取此溶液5 ml加蒸馏水稀释至50 ml，即为0.1 mg/ml 牛血清蛋白标准液。

4.3 标准曲线绘制

  分别吸取0.0mL、0.1mL、0.3mL、0.5mL、0.5mL、0.7mL、0.9mL牛血清蛋白标准液，置于10 ml具塞试管中，各加蒸馏水至1 ml，再加入5 ml的考马斯亮蓝G-250溶液，将试管内的溶液混匀，室温下放置2 min，以1 ml蒸馏水加5 ml的考马斯亮蓝G-250溶液为空白，在595 nm下测定溶液吸光度，绘制标准曲线。

五、样品测定

  分别吸取清蛋白提取液、球蛋白提取液、醇溶蛋白提取液、谷蛋白提取液1.0mL于试管中，再加入5 ml的考马斯亮蓝G-250溶液，将试管内的溶液混匀，室温下放置2 min，以空白管凋零，在595 nm下测定溶液吸光度，根据吸光度查标准曲线或按回归方程计算，求出样品中的蛋白质含量。

六、结果计算

  样品中的各蛋白组分含量按下式计算：X=C×Vt÷m÷Vs  

式中，C：查标准曲线得到的蛋白质浓度值;Vt:提取液总体积（mL）;Vs:测定时加样量（mL）;m:样品重量（g）。