葡萄糖、果糖、蔗糖和山梨醇的测定

1、测定原理

试样用甲醇提取,经固相萃取小柱净化、稀释、阴离子交换柱分离，脉冲安培检测器测定，保留时间定性，峰面积外标法定量。

2、样品制备
取新鲜组织样本，液氮研磨混匀备用。

3、样品处理   

称取2 g试样至50 mL离心管中,加入30 mL甲醇混匀,40 kHz的频率下室温超声提取20 min,9 000 r/min 离心15 min,上清液转移至50 mL,容量瓶中,残渣再用10 mL甲醇按上述步骤重复提取1次,合并2次提取液,用甲醇定容至刻度,摇匀,得到样品提取液。

吸取1.00 mL样品提取液于50 mL.容量瓶中,用水定容至刻度。依次用5 mL,甲醇和5 mL水预淋洗、活化固相萃取小柱。吸取5 mL.稀释后的样品提取液加入活化好的固相萃取小柱中过滤净化,弃去2mL初始滤液,收集滤液供离子色谱分析测定。

4、样品测定

（1）色谱条件

  a)色谱柱:阴离子交换柱(PA10),250 mm×4.0 mm;

  b）柱温:30 “℃;

  c)流动相:A为水,B为200 mmol/L氢氧化钠溶液;

  d)流速; 1 mL/ min;

  e)进样量:10 pL;

  f)工作电极:Au电极;

  g)参比电极:Ag/AgCl参比电极;

  h)检测池温度:30 ℃;

（2）标准系列溶液测定
标准储备液(1.0 mg/mL):分别称取葡萄糖、果糖、蔗糖、山梨醇各50 mg于4个50 mL容量瓶中,用水溶解并定容,配制成1.omg/mL的标准储备液。  

标准工作溶液:分别量取0.50mL、1. 00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL葡萄糖、果糖、蔗糖标准储备液和0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00 mL、1.20mL山梨醇标准储备液于6个100 mL容量瓶中,用水稀释至刻度,配置成4种糖组分的混合标准溶液,混合标准溶液中葡萄糖、果糖、蔗糖的浓度分别为5.0mg/L、10.0mg/L、20.0mg/L、30.0mg/L、40.0mg/L、50.0mg/L，山梨醇浓度分别为2.0mg/L、4.0mg/L、6.0mg/L、8.0mg/L、10.0mg/L、12.0mg/L。  

按照设定的色谱工作条件,待仪器稳定后,依次测定系列标准工作溶液中葡萄糖,果糖,蔗糖和山梨醇的色谱峰面积。以系列标准工作溶液中葡萄糖,果糖、蔗糖和山梨醇的浓度为横坐标,以相应峰面积为纵坐标,绘制葡萄糖、果糖,蔗糖和山梨醇的浓度-色谱峰面积标准曲线。

（3）试样溶液的测定
将试样溶液注入离子色谱仪中,得到峰面积。以保留时间定性，试样溶液中糖组分保留时间应与标准系列溶液中糖组分的保留时间一致。 将试样溶液测定的响应值(峰面积)进行定量。

5、结果计算   

试样中葡萄糖,果糖,蔗糖和山梨醇的含量以质量分数W计。
    W=C*V*f/m/10000
    式中:
    W——试样中葡萄糖,果糖,蔗糖或山梨醇的含量，g/100g；
    C——试样溶液中葡萄糖,果糖,蔗糖或山梨醇的浓度，mg/L；
    V ——试样提取溶液的总体积，mL；
    m ——试样质量，g；  10000——换算系数；  f ——超出线性范围后，需要进一步稀释的倍数。