土壤磷酸酶活性的测定 （磷酸苯二钠比色法）

一、实验原理

以磷酸苯二钠为基质，在磷酸酶的作用下，基质水解生成酚，使其与氯代二溴对苯醌亚胺试剂反应生成蓝色，颜色深度与酚含量呈正相关，用比色法测定游离的酚含量来表示磷酸酶的活性。

二、实验试剂

1. 甲苯（C7H8 ）

2.冰醋酸（C2H4O2 ）

3.无水醋酸钠（C2H3O2 Na）

4.柠檬酸（C6 H8 O7 ）

5.磷酸氢二钠（Na2 HPO4 ）

6.四硼酸钠（Na2 B4 O7 ·10H2 O）

7.氢氧化钠（NaOH）

8.硫酸铝（Al2 (SO4)3 ）

9.磷酸苯二钠（C6 H5 Na2 PO4 ）

10.苯酚（C6 H6 O）

11.氯代二溴对苯醌亚胺（C6 H2 Br2 ClNO）

12.柠檬酸盐缓冲液（pH7.0） 

13.磷酸苯二钠溶液（5 g/L） 

称取5g（精确至0.01g）磷酸苯二钠，用柠檬酸盐缓冲液溶解定容至1L。 

14.氯代二溴对苯醌亚胺试剂 称取0.125g（精确至0.0001g）氯代二溴对苯醌亚胺，用10mL96%乙醇溶解，贮于棕色瓶中，放冰箱4℃冷藏保存。

15.硫酸铝溶液（3 g/L） 

称取3g（精确至0.01g）硫酸铝，用水溶解定容至1L。 

16.酚标准溶液（1 mg/mL） 4.16.1 酚储备液 准确称取1g（精确至0.0001g）苯酚溶于水中，定容至1L，存于棕色瓶中。

17.酚工作液（0.01mg/ml） 准确移取10.00mL酚储备液，用水定容至1L。 

三、实验步骤

准确称取5 g（精确至0.0001 g）土样置于100 mL具 塞三角瓶中，加入2.5mL甲苯，轻摇15min后，加入20mL5g/L磷酸苯二钠溶液 ，仔细摇匀后放入恒温培养箱，37℃±1℃下培养24h后取出，在培养液加入100 mL 3 g/L硫酸铝溶液摇匀，并过滤。准确吸取3.00 mL滤液于50 mL容量瓶中， 按绘制标准曲线方法显色，呈现蓝色，于分光光度计660nm处比色。 

标准曲线绘制：准确吸取0.00、1.00、3.00、5.00、7.00、9.00、11.00、13.00 mL 酚工作液，置于50mL容量瓶中，每瓶加入5mL缓冲液和4滴氯代二溴 对苯醌亚胺试剂，显色后用水稀释定容至刻度，配成浓度为0.0、0.2、0.6、1.0、 1.4、1.8、2.2、2.6ug/mL的一组标准浓度。30min后，于分光光度计上660nm处比色。 以显色液中酚浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

四、结果计算

土壤磷酸酶活性以24h，1g风干土壤可水解生成酚的量（mg）表示，按下式计算：

式中：

 X样品中磷酸酶的含量，单位为毫克每克每24小时（mg/g·24h）；

 C1样品加基质吸光值由标准曲线求得的酚含量，单位为微克每毫升（ug/mL）； 

C2样品未加基质吸光值由标准曲线求得的酚含量，单位为微克每毫升（ug/mL）； 

V显色液定容体积，单位为微升（mL）； N为分取倍数=浸出液体积（mL）／吸取滤液体积（mL）；

 M表示新鲜土壤质量，单位为克（g）；

 f表示风干土壤占新鲜土壤的比例。