土壤抗生素土霉素、金霉素、四环素测定

四环素类抗生素是常用抗生素，因其具有质优价廉、广谱抗菌性的特点，在畜禽生产中应用非常广泛。土壤中土霉素、金霉素、四环素的残留主要来源于畜禽养殖。畜禽粪便作为有机肥被广泛用于农业生产，每年由此进入土壤的抗生素很多，抗生素通过粪肥施用进入土壤环境，连续的施用导致抗生素持续残留，在土壤中不断积累，造成土壤抗生素污染。四环素类抗生素在环境中比较稳定，其半衰期长达20天到半年环境中的抗生素虽然浓度比较低，但由于来源稳定，其浓度在环境中基本能够保持稳定，可能被植物吸收而在植物体内形成抗生素残留，在畜禽粪便、废水和土壤等环境基质中经常可检出兽药残留。

一、测定原理

试样经Na2EDTA-Mcllvaine-甲醇溶液提取定容，HLB固相萃取小柱净化，经高效液相色谱仪测定外标法定量。

二、实验试剂

所用试剂均为分析纯。乙腈:色谱纯、甲醇:色谱纯、磷酸氢二钠、乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸、水合草酸

磷酸氢二钠溶液(0.4 mo1/L):称取 143.26g磷酸氢二钠，用水溶解，定容至 1000mL。

乙二胺四乙酸二钠溶液(0.1 mo1/L):称取 37.22g乙二胺四乙酸二钠，用水溶解，定容至 1000mL。

柠檬酸溶液(0.2 mo1/L):称取42.03g柠檬酸，用水溶解，定容至1000m。磷酸氢二钠-柠檬酸(Mcllvaine)缓冲液(pH=6.8±0.05):将1000 mL 0.4 mo1L 磷酸氢二钠溶液与294 mL 0.2 mo1/柠檬酸溶液混匀。

Na2EDTA-Mcllvaine-甲醇提取液:取Na2EDTA·2H20、磷酸氢二钠-柠檬酸(Mcllvaine)缓冲液和甲醇按1+1+2(体积)比例混匀，必要时用Na0H溶液或HC1溶液调节 pH=7.20±0.05。

草酸溶液(0.01 mo1/L):称取 1.26g草酸，用水溶解，定容至1000 mL。

甲醇-水(1+19):量取5 m甲醇与 95 m 水混匀。

草酸-甲醇溶液(0.01 mo1/L):称取 1.30g草酸，用甲醇溶解，定容至 1000 mL。

土霉素(oxytetracycline)标准物质:纯度大于等于96.5%、四环素(tetracycline)标准物质:纯度大于等于94.2%、金霉素(chlortetracycline)标准物质:纯度大于等于99.5%。

土霉素、四环素、金霉素标准储备溶液(2.00mg/mL):准确称取一定量的土霉素、四环素、金霉素标准物质于100mL容量瓶中，分别用甲醇溶解定容。

土霉素、四环素、金霉素混合标准溶液(100g/mL):分别取5mL土霉素、四环素、金霉素标准储备液至100mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，混匀。

土霉素、四环素、金霉素混合标准溶液使用液(20μg/mL):吸取土霉素、四环素、金霉素混合标准溶液10mL至50mL容量瓶中，用 Na2EDTA-Mcllvaine-甲醇提取液稀释至刻度混匀。

固相萃取柱(N-乙烯基吡咯烷酮和二乙烯苯的共聚体-HLB或相当者):60mg/3mL。使用前依次使用5甲醇及5水预处理，保持柱体湿润。

针式过滤头:0.22m(有机相)。

三、样本提取

称取过筛样品1 g~2 g(精确至0.01 g)于50 m具塞离心管中，加入20 mL Na2EDTA-Mcllvaine-甲醇提取液，室温振荡20min，于 3500r/min离心10min，取上清液至另一离心管中。残渣中再依次加入20mL、10mLNa2EDTA-Mcllvaine-甲醇提取液，重复提取两次，合并上消液并定容至50mL。

四、净化

移取上清液5mL于具塞离心管中，置于氮吹仪上，40℃浓缩至原体积的一半左右，加适量水稀释至体积约5 mL，控制流速以1mL/min的速度通过已活化处理的HLB固相萃取柱，用5 mL甲醇-水淋洗固相萃取柱，弃去全部流出液。真空抽干10min，用5mL草酸-甲醇洗脱液洗脱，收集洗脱液并在40℃氮吹浓缩至近干，用2.00 mLNa2EDTA-Mcllvaine-甲醇提取液涡旋溶解残渣，过0.22μm滤膜进行测定。

五、液相色谱仪条件

色谱柱:C18色谱柱，柱长250mm，内径4.6mm，粒径5.0 um。

流动相及梯度洗脱条件:见表1。

流速:1.0 mL/min。

检测波长:355 nm。

柱温:30℃。

进样量:20μL。

六、液相色谱测定

分别移取不同体积20μg/mL混合标准溶液使用液于10mL容量瓶中，用Na2EDTA-Mcllvaine-甲醇提取液定容至刻度，逐级稀释配制成0.1μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL和20.0g/mL的系列标准工作液，进样测定。以色谱峰面积进行外标法定量。标准品液相色谱图参见附录A。

七、结果计算

样品中被测组分的含量X，数值用毫克每千克(mg/kg)表示：

X=C x f x V x 1000 / m / 1000

式中:

X-样品中被测组分含量，单位为毫克每千克(mg/kg);

C-从工作曲线得到的被测组分溶液浓度的数值，单位为微克每毫升(ug/m);

f-稀释倍数;

V-样品的稀释液定容体积，单位为毫升(mL);

m-样品称样量，单位为克(g)。