过氧化氢酶活性测定

植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而使H2O2发生累积。过氧化氢酶可以清除H2O2，是植物体内重要的酶促防御系统之一。因此，植物组织中过氧化氢酶活性与植物的抗逆性密切相关，本实验利用高锰酸钾滴定法测定过氧化氢酶活性。

一、实验原理

过氧化氢酶（CAT）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。在反应系统中加入一定量（反应过量）的H2O2溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的H2O2，即可求出消耗的H2O2的量。

二、实验仪器

研钵、三角瓶50m、酸式滴定管（10ml）、恒温水浴、容量瓶25ml。

三、实验试剂

10% H2SO4；

0.2mol/L磷酸缓冲液pH7.8； 

0.1mol/L高锰酸钾标准液：称取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml，用0.1mol/L草酸溶液标定； 

0.1mol/L H2O2：市售30% H2O2大约等于17.6mol/L，取30% H2O2溶液5.68ml，稀释至1000ml，用标准0.1mol/ KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定； 

0.1mol/L草酸：称取优级纯H2C2O4·2H2O 12.607g，用蒸馏水溶解后，定容至1L。

四、测定步骤

1.酶液提取  取样品2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转入容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000rpm离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。 

2.取50ml三角瓶4个（两个测定两个对照），测定瓶中加入酶液2.5ml，对照瓶中加入煮死酶液2.5ml，再加入2.5ml 0.1mol/L H2O2，同时计时，于30℃恒温水浴中保温10min，立即加入10% H2SO4 2.5ml。 

3.用0.1mol/L KMnＯ4标准溶液滴定H2O2，至出现粉红色（在30min内不消失）为终点。

五、结果计算  

酶活性用每克鲜重样品1min内分解H2O2的毫克数表示： 

过氧化氢酶活性(mg/g·min)＝（A-B）×VT÷Vs×1.7÷W÷t

式中：

A—对照KMnO4滴定毫升数； 

B—酶反应后KMnO4滴定毫升数；

VT—提取酶液总量（ml）； 

Vs—反应所用酶液量（ml）; 

W—样品鲜重（g）； 

t—反应时间（min）； 

1.7—1ml 0.1mol/L的KMnO4相当于1.7mg H2O2。