土壤纤维素酶活性测定

土壤纤维素酶活性测定 （3，5- 二硝基水杨酸比色法）

一、原理 

纤维素是植物残体进入土壤的碳水化合物的重要组分之一。在纤维素酶作用下,它的最初水解产物是纤维二糖，在纤二糖酶作用下，纤维二糖分解成葡萄糖。纤维素酶解所生成的还原糖与 3,5- 二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸。颜色深度与还原糖量相关,因而可用测定还原糖量来表示纤维素酶的活性。

二、试剂 

1）甲苯 

2）1%羧甲基纤维素溶液：1g 羧甲基纤维素钠,用50％的乙醇溶至100ml. 

3）pH5.5醋酸盐缓冲液： 

0.2mol/L 醋酸溶液  11.55ml 95％ 冰醋酸溶至1L。 

0.2mol/L 醋酸钠溶液  16.4g C2H3O2Na溶至1L。 

取11ml 0.2mol/L 醋酸溶液和88ml 0.2mol/L 醋酸钠溶液混匀即成PH 5.5醋酸盐缓冲液. 

4)3，5—二硝基水杨酸溶液:称1.25g二硝基水杨酸,溶于50ml 2mol/LNaOH和125ml水中，再加75g酒石酸钾钠，用水稀释至250ml。

5)葡萄糖标准液(1mg/mL）  

准确称取50mg葡萄糖于烧杯中,用蒸馏水溶解后，移至50mL容量瓶中，定容，摇匀。

三、操作步骤 

葡萄糖标准曲线：分别吸1mg/mL的标准葡糖糖溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL于试管中,再补加蒸馏水至1mL，加DNS溶液3ml混匀，于沸腾水浴中加热5min，取出立即泠水浴中冷却至室温，以空白管调零在波长540nm处比色，以OD值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。 

称10g土壤置于50ml三角瓶中，加入1.5ml甲苯，摇匀后放置15min，再加5ml 1％羧甲基纤维素溶液和5ml pH5.5醋酸盐缓冲液,将三角瓶放在37℃恒温箱中培养72h.培养结束后,过滤并取1ml滤液，然后按绘制标准曲线显色法比色测定。(为了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的误差，每一土样需做无基质对照，整个试验需做无土壤对照；如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样。）     

四、结果计算

纤维素酶活性以72h,1g干土生成葡萄糖毫克数表示。 

纤维素酶活性=（a样品－a无土－a无基质）×n／m 

a样品、a无土、a无机质分别表示其由标准曲线求的葡萄糖毫克数；n为分取倍数；m表示土重