土壤脲酶活性检测

一、测定原理     

土壤中脲酶活性的测定是以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚-次氯酸钠作用生成蓝色靛酚，颜色深浅与氨的量相关，通过测定氨量来表示脲酶的活性。

二、实验试剂

（1）10%尿素：称取10g尿素，用蒸馏水溶至100ml；

（2）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184克柠檬酸和147.5克氢氧化钾溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/L NaOH将PH调至6.7，用水稀释至1000毫升； 

（3）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5克苯酚溶于少量无水乙醇，加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮，用无水乙醇稀释至100毫升（A），存于冰箱中；27克NaOH溶于100毫升水（B）。使用前将AB溶液各20毫升混合，用蒸馏水稀释至100毫升； 

（4）次氯酸钠溶液：取活性氯≥5.5%的次氯酸钠溶液，用水稀释试剂至活性氯的浓度为0.9%；

（5）氮的标准溶液（0.1mg/ml）：精确称取0.4717克硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有0.1mg氮的标准液。使用时将其稀释10倍，即为氮工作液（0.01mg/ml）； 

（6）甲苯。

二、标准曲线绘制

精确称取0.4717 g硫酸铵溶于水并稀释至1 000mL,则得含氮0.1 mg/mL的标准液。绘制标准曲线时,可再将此液稀释10倍供用，即为氮工作液（0.01mg/ml）。吸取稀释的标准液1、3、5、7、9、11、13 mL,移于50 mL容量瓶中,加蒸馏水至20 mL,再加4 mL苯酚钠溶液和3 mL次氯酸钠溶液,随加随摇匀。20 min后显色、定容。1 h内在分光光度计上波长578 nm处比色。以光密度值为横坐标、以氨的浓度为纵坐标绘制标准曲线。

四、脲酶活性测定步骤

（1）取5 g风干土盛于50 mL三角瓶中,加入1 mL甲苯。15 min后加10 mL 10%尿素溶液和20 mL pH值6.7的柠檬酸盐缓冲液,摇匀,在37℃恒温箱中培养24 h。

（2） 过滤后取3 mL滤液注入50 mL容量瓶中,加蒸馏水至20 mL。再加4 mL苯酚钠溶液和3 mL次氯酸钠溶液,随加随摇匀,20 min后显色、定容。1 h内在分光光度计上波长578 nm处比色。

（3）无基质对照：以等体积水代替基质，其他与实验相同。每一个样品应该做一个无基质对照，以等体积的蒸馏水代替基质，其他操作与样品实验相同，以排除土样中原有的氨对实验结果的影响。

五、结果计算　　

土壤脲酶活性以24 h后1 g土壤中含NH3-N的毫克数表示。       

NH3－N=（a样品－a无基质）×V×n／m      

式中：a样品--为样品吸光值由标准曲线求得的NH3－N浓度（mg/mL）；

a无基质--为无基质对照吸光值由标准曲线求得的NH3－N毫克数；V--为显色液体积；n--为分取倍数，浸出液体积／吸取滤液体积；m--表示样品重。