LC-MS/MS法检测地表水中五种生物胺

生物胺是一类具有生物活性含氮的低分子量有机化合物的总称，生物胺是生物体内正常的活性成分，在体内起着重要的生理作用。大多数食品中都含有生物胺，这些生物胺主要由微生物氨基酸脱羧酶作用于氨基酸脱羧而生成。适量生物胺可促进人体的正常生理活动，而过量摄入会产生不良反应。

动植物尸体在微生物作用下，体内的氨基酸等含氮化合物可转变产生大量生物胺，我国水产品卫生标准GB2733-2005就曾明确限定了市售、非活水产品中组胺的含量。地质灾害以及某些特定事故常致使大量动物体尸体不能被及时有效地处理，尸体腐败变质后释放出的大量生物胺将浸入地下水系统，引发水体污染，如浸入供水系统，摄入过量将促使人体肾上腺素和去甲肾上腺素的释放加剧，诱发恶心、心悸、呼吸紊乱等强烈过敏反应，甚至危害生命安全。因此，必须建立一种快速响应的生物胺分析测定方法，以保障在特定事件发生后迅捷地完成地下水中生物胺含量的实时监测，保障周边居民饮用水安全。

1  高效液相色谱串联质谱检测实验设计

1.1  仪器选择

本次生物胺检测实验主要仪器为 Agilent 1290 Infinity Ⅱ型号的高效液相色谱仪、6460 Agilent Triple Quad 型号的三重四级杆质谱仪、AutoEVA-60 型号的全自动平行浓缩仪、GX-274 自动固相萃取仪、DSX-18 型固相萃取柱等。

测定的五种生物胺分别为腐胺、尸胺、2-苯乙胺、色胺和酪胺，以上五种生物胺标准液产品分别为美国CHEM SEVICE 公司生产的10g腐胺标准液、美国 DrEhrenstorferGm_bH 公司生产的 0.25g、99% 的尸胺标准液、日本东京仁成工业株式会社生产的 25mL 2-苯乙胺标准液、美国 AXROS公司生产的 5g、98% 的酪胺标准液和美国&Kchemica公司生产的10g、98% 色胺标准液[1]。其他辅助性试剂包括乙酸铵、甲酸、氨水、甲醇、二氯甲烷、丙酮、超纯水等。

1.2  样本制备

取腐胺、尸胺、2- 苯乙胺、色胺和酪胺五种生物胺标准品各适量，添加实验用超纯水，配置成 1mg/mL 的标准水溶液储备液，将其放在 4℃恒温恒湿的环境中保存。实验前，需对储备液进行加水稀释，得到目标浓度的试验样本。

进行水样萃取，取 100mL 地表水水样，将其透过 0.45µm 的滤膜，过滤后上样至固相萃取柱上，然后使用 8mL 乙腈及对固相萃取柱做洗脱处理，采集洗脱液，再使用全自动平行浓缩仪将样本处理定容至 1mL。
1.3  实验条件
1.3.1 色谱条件
色谱柱：Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18 柱，规格为100×2.1mm、3.5µm，由美国安捷伦科技公司生产。进样体积：10µL。柱温 35℃。流动相：50%、10mmol/L 的甲酸铵，pH=2 的甲酸缓冲液。
1.3.2 质谱条件
电喷雾离子源。负离子扫描。毛细管电压为3500V。干燥气：温度为300℃，流量为5L/min。雾化器压力：300kPa。鞘气：温度为 250℃，流量为 12L/min。反应监测母离子、子离子、碰撞能量的色谱调谐条件：腐胺、尸胺、2- 苯乙胺、色胺和酪胺五种生物胺的母离子的调谐条件分别为 89.2m/z、103m/z、123m/z、162m/z 和 136m/z；子离子的调谐条件分别为 55.5m/z、69.1m/z、77.4m/z、117.0m/z 和 77.2m/z；碰撞能量的调谐条件分别为20V、15V、30V、25V 和 29V。
1.4  检测方法
精确量取10mL水样，添加浓度为2mol/L的氢氧化钠溶液和饱和碳酸钠溶液，调节样本pH值到12。然后添加浓度为5mg/mL的丹磺酰氯-丙酮溶液2mL和250µL的二氯甲烷，振荡混合均匀后，在50℃的水浴锅中加热20min，促使样本中物质充分反应。

2  地表水中五种生物胺检测结果分析

2.1  实验条件优化
2.1.1 色谱条件优化
比较不同流动相下五种生物胺的色谱峰形，发现在甲醇+水或甲醇+甲酸铵/氨水条件下，色谱分析的峰形为扁平状，且存在较严重的拖尾，出峰时间稳定在 1min 左右。在甲醇+甲酸铵/甲酸条件下，色谱分析的波形得到显著优化，且出峰时间的独立性更高，因此考虑到实验结果观察的清晰性，决定以甲醇+甲酸铵/甲酸作为流动相。
2.1.2 质谱条件优化
对生物胺单体标准样本进行质谱扫描，得出正确的 [M+H]+ 分子离子峰，轰击促使发生二次碎裂得到子离子。对分子离子及信号强度在3个的子离子进行检测，得到最佳质谱条件，以提高生物胺检测的精度和灵敏性。
2.1.3 前期处理优化
选取腐胺和尸胺两种生物胺，分析不同处理条件下腐胺和尸胺的回收率情况，以找出最佳的前期处理条件。萃取条件。在分析水样中尸胺及腐胺成分时，选择了几种不同的固相萃取柱，其中MCX萃取柱和DSC-18萃取柱在腐胺及尸胺检测无回收，而HLB固相萃取柱对腐胺和尸胺的回收率分别达到89.6%和90.5%，因此最终选择HLB固相萃取柱 [2]。pH 值。本实验设定了三组 pH 值，分别为 2、7 和 12，测试在酸性、中性和碱性条件下，生物胺的检测情况，最终发现当实验条件为酸性或中性时，生物胺无回收，而pH=12时，腐胺和尸胺的回收率分别达到86.1% 和 90.9%，因此决定将 pH 调节为12。
洗脱液。当选用HLB固相萃取柱开展实验时，流速设定为5mL/min，分别检验乙腈、甲醇、二氯甲烷与丙酮的等量混合液作为洗脱机时的实验效果，发现当选择混合型洗脱液时，处理完毕需进行转溶剂操作，因此将该洗脱液排除，进一步分析当洗脱液为乙腈或甲醇时，腐胺和尸胺的回收率情况。最终发现使用乙腈时腐胺和尸胺的回收率要明显高于甲醇（12.2% 和 14.6%），为 89.8% 和 93.1%，因此最终选用乙腈为洗脱液。
2.2  实验结果分析
2.2.1 标准曲线绘制
为检验高效液相色谱串联质谱法在地表水生物胺分析可行性高低，分别对五种生物胺不同浓度梯度的标准样本进行衍生和萃取处理，设定横坐标为浓度、纵坐标为测定得出的峰面积，绘制生物胺检测的标准曲线。五种生物胺的线性方程、相关系数和线性范围如表 1 所示。
2.2.2 检出限分析
实验得出腐胺、尸胺、2- 苯乙胺、色胺和酪胺五种生物胺的检出限分别为 0.08μg/L、0.08μg/L、5.0μg/L、3.0μg/L 和 3.0μg/L。

2.2.3 检测精度
分别选取五种生物胺三种不同浓度下的标准溶液，以前文给出的分析条件开展平行试验，得到每次试验的标准偏差。发现当在低浓度条件下，腐胺、尸胺的相对标准误差随浓度的上升而下降，2- 苯乙胺在中等浓度水平时，其相对标准误差最低，色胺和酪胺的相对标准误差随浓度上升而下降 [3]。
2.2.4 回收率分析
在某地表水水域采集水样，利用以上实验方法进行生物胺检测，设置两种浓度条件，以验证高效液相色谱串联质谱法在地表水五种生物胺检测中的回收率。当浓度条件为 0.5μg/mL 时，五种生物胺的回收率分别为 82、93、80、80 和 86。当浓度条件为 1.0μg/mL 时，五种生物胺的回收率分别为 89、83、90、81 和 80。两种浓度下样本的加标回收率均在 89.4% ～ 122.1% 之间。在使用高效液相色谱串联质谱法开展地表水生物胺检测时，检测精度和操作便捷性均较传统检测方法存在明显优势，需在以后的水环境监测中做重点推广。

3  结论

使用高效液相色谱串联质谱法，检验地表水水样中五种生物胺含量，当选用HLB固相萃取柱，并以乙腈作为洗脱液，将甲醇与甲酸铵/甲酸比例设置为 20:80、pH 条件为12时，五种生物胺的回收率均达到89.4%以上，且标准偏差位于 2.17% ～ 11.6% 之间，检测操作难度适中，且检测周期较短。随着水污染治理力度的进一步加深，水环境监测及地表水物质分析工作也将频繁开展，建议相关人员加强对高效液相色谱串联质谱法在地表水生物胺检测中的研究，进一步提高污染检测能力。