土壤酶活性影响因素及测定方法的研究进展

土壤酶是指土壤中的聚积酶，包括游离酶、胞内酶和胞外酶，主要来源于土壤微生物、植物根系分泌物和动植物残体腐解过程中释放的酶。按照酶的催化反应类型和功能，将其分为 6 大类，即氧化还原酶、水解酶、转移酶、裂合酶、连接酶和异构酶，土壤中广泛存在的是氧化还原酶类和水解酶类。酶是土壤组分中最活跃的有机成分之一，其活性不仅能反映土壤物质能量代谢的旺盛程度，还可作为评价土壤肥力与生态环境质量的一个重要指标。在几乎所有生态系统的监测和研究中，土壤酶活性成为了必不可少的测定指标。研究土壤酶对培肥土壤，土壤污染治理，土壤科学利用与管理等方面具有重要意义。

1土壤酶活性的影响因素

1. 1 土壤微生物

土壤微生物是土壤生态系统的核心，直接或间接参与调节土壤养分循环、能量流动、有机质转换、肥力形成、污染物的降解及环境净化等。土壤微生物的种类和组成不同，对土壤酶活性在质和量上都引起差异，特别对土壤脲酶活性影响很大。土壤脲酶是一种分解含氮有机物的水解酶，普遍存在于真菌中，是植物氮素营养的直接来源。土壤细菌、真菌、总微生物数量与过氧化氢酶、脲酶、纤维素酶和中性磷酸酶活性呈显著或极显著相关，这在很大程度上反映了微生物数量对土壤酶活性的重要影响和贡献。

1. 2 土壤理化性质

土壤理化性质对土壤酶活性的影响是明显的，主要包括土壤水分、空气、热量、酸碱度、有机质等。一方面，其对土壤微生物的类型和活性影响显著，因此，必然对土壤酶的活性产生显著影响; 另一方面，不同理化条件会直接影响土壤酶的存在状态与活性。

土壤水分过低和过多都不利于土壤微生物和动植物的生长和繁衍，减少了土壤酶的来源，土壤酶活性较低。水分对酶活性的影响因其种类而异，土壤风干会显著地降低纤维素酶、蛋白酶活性，而酸性磷酸酶、脲酶及 β－葡萄糖苷酶活性几乎不受影响; 而土壤水分增加会降低土壤过氧化物酶和多酚氧化酶活性，水解酶活性降低不显著。

土壤空气状况对酶活性有较大影响，有研究表明，由于湿地常年积水或季节性积水，导致湿地土壤通气不良，处于缺氧状态，在显著缺氧的条件下多酚氧化酶活性被抑制，致使多酚化合物累积。而酚类物质能够抑制其他不需要氧的水解酶的作用，如磷酸酶、硫酸酯酶和 β－葡萄糖苷酶，进而抑制土壤有机质的降解速率。

土壤温度对酶活性也有较大影响，土壤温度可通过影响微生物间接影响酶活性，还可通过影响酶促反应的的动力学过程而直接影响酶活性。每种酶都有其活性的最适温度，通常温度过低时，酶活性会降低，但在一定范围内酶活性会随着温度的升高而增加; 但温度过高时，土壤酶可能会变性，并丧失本身的活性。

土壤酸碱性可以改变酶促反应基点和土壤所吸附的酶的稳定性，某些酶促反应对 pH 值变化很敏感，甚至只能在较窄的 pH 范围内进行。有研究发现，土壤酶的两个最适为 pH = 6. 5 ～ 7. 0 或 pH = 8. 8 ～ 9. 0，土壤磷酸酶的最适 pH 值为 4. 0 ～ 5. 0，6. 0 ～ 7. 0，8. 0 ～ 10. 0，分别称为酸性、中性、碱性磷酸酶。当 pH 值在 5. 0以下时，过氧化氢酶和脱氢酶的活性几乎完全丧失，而转化酶和脲酶受酸度的影响较小。

有机质是土壤微生物和酶的有机载体，也是土壤肥力的主要物质基础。土壤有机质含量对土壤酶的活性有着重要影响，其相关性因酶的种类而不同。有研究表明: 有机质、全 氮、全磷、碱解氮、速效磷与脲酶、碱性磷酸酶活性呈显著或极显著相关，而与蔗糖酶、多酚氧化酶相关性不显著，土壤养分与土壤脲酶之间的相关性最好，与磷酸酶和过氧化氢酶存在显著相关，但与转化酶和纤维素酶活性之间没有良好的相关性。

1. 3 耕作、施肥、使用农药等农业措施

土壤耕作方式会影响土壤酶的分布和活性。在轮作方式下，土壤脲酶、蔗糖酶、酸性和碱性磷酸酶活性高于单作方式。长期定位试验表明，土壤酶在识别不同的土壤管理措施的效果时较敏感 。不同培肥方式对土壤酶活性有明显影响，脲酶反应最显著，过氧化氢酶反应则较差，说明脲酶是评价土壤质量的理想指标。作物能明显增强土壤水解酶活性; 秸秆和化肥配合处理可提高土壤的总体酶活性; 对其作主成分分析，发现起主要作用的是土壤脲酶和磷酸酶。

2 土壤酶活性的测定

2. 1 土壤样品的采集及贮存方法

土壤酶主要来源于活的微生物，所以土壤酶活性对环境的变化很敏感，为了能有效地反映土壤的实际情况，在分析测试之前采取可靠、有效的采样及贮存方法是获得正确研究结果的前提。在采集土壤样品时，首先要根据实验需要确定采样地和土层的深度，在采样地中一般采用五点取样法，而后混合同深度的土层土样，根据实验需要设置重复，最少为 3 个重复。对采集的土壤样品立即进行分析测试是较为理想的情况，但大多数情况下是难以实现的，因此怎样贮存土壤样品，一直是土壤酶研究者们所关心的问题。

土壤酶的贮存有两种常见方式: 一种是低温贮存，另一种是风干贮存。不同的贮存方式都会对土壤酶活性产生影响，其影响程度则与土壤酶种类、土壤类型及土壤样品的管理等因素有关。总的影响趋势是贮存会降低大多数土壤的酶活性。已经采集的土壤样品，其酶活性的分析测定最好能在短期内完成，如需要贮存可根据贮存时间、贮存条件等因素综合分析确定。如需贮存几周时间，一般是在4℃ 条件下，其次是在－20℃环境下贮存; 如需贮存几个月甚至更长时间一般要选择风干贮存; 对风干后酶活性受影响不大的土壤，应尽量选择风干处理，这样不仅方便而且节约; 此外，对于同一种酶的分析测试应尽量在同一天或者几天之内完成，以最大程度的降低样品贮存所造成的影响。

2. 2 土壤酶活性的测定方法

2. 2. 1 测定原理

土壤酶的测定是进行土壤酶研究的基础。由于土壤酶吸附在矿物胶体和腐殖质等物质上，提取土壤酶存在很大困难，因此常通过测定土壤酶的活性来了解其丰缺情况。土壤酶活性测定原理为: 通过测定一定量的底物在酶促反应后的产物量或剩余底物量来间接测得，反应公式为:

其中 E 代表参与反应的酶; S 表示底物; P 为反应产物，此原理适应于脲酶、磷酸酶、蔗糖酶等多种酶活性的测定。

2. 2. 2 测定方法的对比

目前，土壤酶活性的测定方法比较多，但还没有统一方法，常见的有分光比色分析法、荧光分析法、放射性同位素分析法和物理方法如滴定法等，其中常用的是传统的分光比色分析法及新型的荧光分析法。分光比色分析法的基本原理为酶和底物混合经培养后生成某种有色物质，其可在一定波长下产生特征性吸收峰，再用分光光度计测得生成物的含量，由此确定酶活性的大小。到20世纪90年代，酶活性测量的新方法－荧光分析法在国际上快速发展起来，其原理是用萤光团标记底物作探针，通过荧光强度的变化来反映酶活性。传统的比色法测定一般先根据所测酶的种类来选定底物，制作相应的标准曲线，然后对土样进行培养、离心、显色等前处理后在同波长下测定其吸光值，再由标准曲线确定样品中的酶活性。这种方法应用较早，已获得普遍认可，长期以来被国内外研究者所采纳，但其缺点是、操作不够简易且耗时较长，选择性和灵敏度不高。荧光分析法对样品的处理及测定步骤与比色法基本一致，与传统方法相比较，荧光分析技术是一种更为强大的分析手段，具有高选择性、高灵敏度、试样量少、耗时短等优点，同时也存在分析成本较高、底物难于溶解等缺点。

2. 2. 3 测定条件的选择

目前，在常见的测定方法中，不同实验室所采用的底物浓度、缓冲液及其 pH 值、培养温度和培养的时间等还很不统一，但底物的选定应尽量与国际接轨。常见的底物主要有两类: 一类为显色物质，另一类为荧光族物质。在显色物质中，对硝基酚类衍生物是较常见的选择( 见表1) ; 萤光团的光物质常见的有荧光素、香豆素、罗丹明的羟基或氨基取代物。土壤酶最适培养 pH 值的确定，通常是根据不同缓冲液 pH 条件下土壤酶活性的变化来实现的。由于不同土壤酶有各自不同的最适 pH 范围，不同土壤也有不同的 pH 特征，除了研究需要，在酶活性测定过程中追求最适 pH 是不太现实的。因此，在不同土壤酶活性测定的过程中，应尽可能采用与土壤相接近的 pH。温度主要影响酶促反应的反应速度，对反应物浓度影响较小，在一定温度范围内酶的催化作用随着温度的升高而逐渐提高，直至酶失活变性。虽然每种酶都有最适的反应温度，且不同温度下酶活性也不同，但在土壤酶试验过程中过分强调最适温度同样也是不现实的，目前土壤酶的培养温度主要有 37℃和 25℃。目前水解酶的培养时间一般为1～2h，而纤维二糖酶、β－葡萄糖苷酶及 β－乙酰氨基葡萄糖苷酶等的培养时间为 4h。总之，在保证测定结果的质量的前提下，可适当缩短土壤酶培养时间。

3 土壤酶研究前景的展望

土壤是人类生存与发展的重要资源，合理利用和保护土壤环境，已成为各国学者和政府十分关注的重要任务。随着研究方法的日渐完善、测定技术的长足进展，将土壤酶应用与培肥土壤，土壤污染治理，土壤科学利用与管理等方面已取得了一定的成功，但其发展潜力还很巨大，前景十分广阔。

土壤酶活性的研究不应局限在机理上，应加强土壤酶的检测和提取两个方面的应用研究。新技术的研发应不断朝着检测的简单化、快速化、低成本等方向努力; 对于直接提取土壤酶成分，相关技术有待提高，如果提取技术成熟，土壤酶的应用将会有质的飞跃。今后，土壤酶活性的研究应重点关注解决农业、林业、生态环境及其它方面的实际问题。