过氧化氢酶（CAT）活性测定

过氧化氢酶（catalase，CAT）普遍存在于植物组织中，是重要的保护酶之一，其作用是清除代谢中产生的H2O2，以避免H2O2积累对细胞的氧化破坏作用，因而其活性的高低与植物的抗逆性有关。

1.紫外吸收法

1.1.原理

H2O2对240nm波长的紫外光具有强吸收作用，CAT能催化H2O2分解成H2O和O2，因此在反应体系中加入CAT时会使反应液的吸光度（A240）随反应时间降低，根据A240的变化速率可计算出CAT的活性。

1.2.试剂

（1）50 mmol·L-1磷酸缓冲液（pH7.0）.

（2）200 mmol·L-1 H2O和O2溶液：30%H2O和O2 11.36ml溶于磷酸缓冲液中，定量至250mL.

（3）50 mmol·L-1 Tris-HCl缓冲液（pH7.0）.

1.3.方法步骤

（1）酶液的提取：称剪碎混匀的植物样品（如叶片等）1.00g置于预冷的研钵中，加适量磷酸缓冲液及少量石英砂，在冰浴上研磨匀浆，转移至10 ml量瓶中，用磷酸缓冲液冲洗研钵2-3次（每次1-2ml），合并冲洗液于量瓶中，定容至10ml，摇匀。取提取液5ml于离心管中，在4℃、15000g下离心15min，上清液即为酶提取液，4℃下保存备用。

（2）CAT酶活性测定：

①取10ml 具塞试管，加2ml酶提取液于沸水浴中加热，冷却备用。

②取10ml 试管4支，3支为测定（3个重复），1支为对照，按下表加入试剂：

③将上述4支试管于25℃水浴中预热3min后，逐管加入0.2ml 200 mmol·L-1 H2O2溶液，每加一管立即在紫外分光光度计上测定A240(蒸馏水调零），每隔30s读数一次，共测3min，记录4支试管的测定值。

（3）结果计算：以1 min内A240降低0.1（3支测定管的平均值）为一个酶活性单位（U），先求出3支测定管各自1min内A240降低值，按下式计算CAT活性。

式中，△A240=As0-(As1+As2+As3)/3;As0:煮死酶液对照管吸光度；As1、As2、As3：样品测定管吸光度；Vt：酶提取液总体积(ml);Vs:测定时取酶液的体积（ml）；FW：样品鲜重（g）