中药多糖成分前处理及检测方法

糖类属于多羟基或多羟基酮及其衍生物或聚合物，包括单糖、寡糖和多糖，是广泛存在于中药中的有机化合物。单糖是该类物质的基本单元，可通过共价键结合生成寡糖和多糖。其中多糖类化合物具有广泛的生物活性。大量研究表明，中药多糖具有降血脂、降血糖、增强免疫、抗肿瘤、抗氧化、抗凝血、抗炎症、抗衰老等生物活性，是近年来中药药效物质基础的研究重点，具有广阔的新药开发前景。但该类成分具有极性强、分子量大、结构难确证等特点，成为中药多糖定性定量分析的难点以及新药开发的瓶颈。
 

1 中药多糖前处理方法
前处理技术是为了最大限度地提取、分离、净化和富集中药中的多糖，便于分析检测。但由于多糖极性强、结构易受破坏，且中药基质复杂、干扰物质多，增大了提取和净化难度，加之提取过程中有机试剂的用量较多，所以需寻找一个选择性强、操作简便、提取效率高、绿色环保且稳定的前处理技术解决中药多糖的检测问题。

1. 1提取方法
1. 1. 1传统提取方法
热水提取法、酸碱提法、酶提法、超声辅助法、微波辅助法等属于中药多糖传统的提取方法，均以极性溶剂提取为基础。这些技术主要是将中药进行粉粹、过筛等处理后，以水、乙醇等极性溶剂提取，并利用水浴加热、振荡、超声、微波、加酶、加酸碱等提高提取效率。

1. 1. 2新型提取方法
高压脉冲电场辅助法、动态高压微射流辅助法、加速溶剂萃取法和超临界流体萃取法属于中药多糖成分的新型提取方法，这些技术均需与溶剂提取相结合。与传统提取方法相比，新型提取技术能够明显提高多糖得率，加快提取速度，且更加绿色环保。
 

1. 2分离净化方法
1. 2. 1传统分离净化方法
溶剂提取后的中药多糖溶液大多含有无机盐、脂质、蛋白质、色素等杂质，需进一步分离纯化。传统分离净化方法包括有机试剂法、蛋白酶法、活性炭或过氧化氢净化法、分级沉淀法。其中，有机试剂法常用于去除蛋白质、脂质及色素。常用的有机试剂为石油醚、三氟乙酸
、无水乙醇、丙酮、乙醚等及其混合溶剂。其中 Sevage 试剂(正丁醇 ∶ 氯仿，按一定比例混合)是常用的去除蛋白质的混合有机溶剂，而石油醚、乙醚等常用于去除脂质。但有机试剂毒性较高且用量较大，易造成多糖成分损失且破坏其结构。
 

1. 2. 2新型分离净化方法
1. 2. 2. 1柱层析法
柱层析法是中药多糖的新型分离净化方法，主要利用选择性吸附和分子筛的作用提高中药多糖纯度。根据萃取柱的类型，主要采用阴离子交换柱、大孔树脂柱和凝胶柱分离净化中药多糖。

1. 2. 2. 2透析法
透析法是利用一定孔径的半透膜使小分子透过，大分子截留的原理，通常将中药溶液装入透析袋，用自来水、蒸馏水透析，将中药多糖大分子物质截留在半透膜中，而无机盐、单糖、双糖等小分子物质透过，实现多糖与小分子寡糖或单糖的分离纯化，比大孔树脂和活性炭吸附法的纯化效果更好。

1. 2. 2. 3超滤法
超滤分离法即膜分离技术，根据相对分子质量差别实现高分子和小分子溶质的分离。该法可在较低压力下明显提高中药多糖的纯度。
 

2 中药多糖检测方法
2. 1含量检测技术
2. 1. 1传统含量检测技术
化学分析法、光谱法、薄层色谱法(TLC)等是用于中药多糖含量测定的传统技术。其中化学分析法包括比色法和滴定法，光谱法包括紫外－可见分光光度法和近红外分光光度法。而比色法与紫外－可见分光光度法相结合常用于中药多糖的含量测定。TLC 具有操作简单、快速、成本低等优点，可实现对中药多糖的单糖组成及含量的测定。而近红外光谱的光谱图复杂，信号重叠严重，很难找出光谱图吸收峰的归属来直接分析样品信息，通常需建立模型才能进行定性和定量，因此目前较少用于中药多糖的含量测定。
 

2. 1. 2新型含量检测技术
2. 1. 2. 1高效毛细管电泳法(HPCE)
HPCE 是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，根据样品中各组分之间淌度和分配行为的差异而实现分离，是近年发展较快的分析技术之一。该方法应用于中药多糖的单糖组成以及含量测定时效果良好，测定多糖含量的能力与化学分析法相当，但需进行柱前衍生，且常与毛细管区带电泳(CZE)的分离机制和紫外检测(UV)器相结合应用。

2. 1. 2. 2高效阴离子交换色谱法(HPAEC)
HPAEC 是检测中药多糖的单糖组成及含量的常用离子色谱法。因中药多糖含有O—H基团，易生成带负电荷的阴离子，利于检测。该方法灵敏度高，重复性好，无需衍生，操作简便，准确可靠。

2. 1. 2. 3气相色谱法(GC)
GC 适用于低沸点、易挥发、热稳定组分分析，但中药多糖的沸点较高、极性强，不能直接进行 GC 检测，需经过柱前衍生。衍生剂包括三氟乙酸盐、乙酸盐、三甲基硅醚、甲醚、三甲基硅烷、糖腈乙酸酯和三甲基硅烷基烷基肟等，其中乙酸盐是常用的衍生化剂。该方法具有所需样品量少、灵敏度高、准确度好等优势，常用于中药多糖中单糖组成的定性定量分析。

2. 1. 2. 4高效液相色谱法(HPLC)
HPLC是根据不同组分在固定相和流动相中吸附或分配系数的差异而达到分离的方法。该技术可串联各类检测器，广泛应用于中药多糖的单糖组成以及含量检测，常采用氨基柱、糖色谱柱及 C18 色谱柱对中药多糖进行分离。HPLC 可串联的检测器包括蒸发光散射器(ELSD)、示差折光检测器(ＲID)、紫外检测器(UV)、荧光检测器(FLD)、四极杆质谱检测器(MS)、三重四极杆质谱检测器(MS /MS)等。一般情况，HPLC串联 ELSD、ＲID 等通用型检测器时，样品无需柱前衍生。由于中药糖类成分基本无紫外－可见吸收基团或荧光基团，当利用 UV、FLD 检测器测定时，均需柱前衍生化,而 PMP 衍生化是 HPLC － UV 较常用的衍生化方法。

质谱(MS) 属于通用型检测器，具有适用范围广、灵敏度高、检测速度快等特点，弥补了传统
ELSD、ＲID、UV、FLD 检测器灵敏度低、选择性差、重复性差等缺点，在中药多糖的含量测定中显示出较大的发展潜力。

2. 2 结构分析技术
2. 2. 1传统结构分析技术
研究多糖的单糖组成是分析多糖结构的基础。通常将中药多糖水解成单糖后，经过衍生化、中和、过滤等操作后，再利用 TLC、HPCE、GC、HPAEC 及 HPLC 等技术实现对多糖的单糖组成检测。其中 GC、HPAEC 和 HPLC 的应用较广泛，这些技术可以检测出多糖的单糖组成及其含量比。另外，高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)是凝胶渗透色谱(GPC)和 HPLC 的结合产物，常用于中药多糖分子量大小和分布范围的检测。

为进一步得到更多的结构信息，高碘酸氧化、Smith 降解和甲基化分析等化学方法也被用于中药多糖的结构分析。高碘酸氧化可通过高碘酸的消耗量以及甲酸的生成量判断多糖中糖苷键的位置和连接方式等结构信息。Smith 降解是将高碘酸氧化物还原后进行水解而推测出糖苷键的键型及其位置等信息。甲基化分析则是通过甲基化试剂将单糖的游离残基全部甲基化，并通过还原和乙酰化反应后采用 GC－MS 检测，从而能推断各单糖的连接方式。

此外，采用 PMP 衍生化标记单糖后，可利用 HPLC－MS 提供的分子一级质谱(即母离子信息)对中药多糖中的单糖标记物结构进行确认和测定。再者，HPLC－MS/MS可提供分子的一级和二级质谱结构信息(即母离子和子离子碎片)对中药多糖的单糖进行确认后测定。另外，糖谱法是多糖通过化学或系列定位酶切等技术获得多糖降解产物片段，并联用色谱等手段实现对中药多糖分离鉴定的技术。该技术在一定程度上可表征一类多糖降解产物的结构特征，且 1 种多糖只有 1 个特征糖谱，可作为中药多糖的指纹图谱。
 

2. 2. 2新型结构分析技术
2. 2. 2. 1傅里叶变换红外光谱法(FTIＲ)
红外光谱(IＲ)是一种电磁波，多糖结构中的基团能够呈现特异的红外吸收光谱，因此 IＲ 可用于中药多糖结构分析。目前 IＲ主要使用波数为 4 000～400 cm－1的波段检测多糖成分，是目前解析多糖结构的一种重要手段。随着仪器技术的发展，FTIＲ 技术在 IＲ的基础上被开发，其灵敏度、信噪比、分辨率、扫描速率、重现性及波长准确性等方面具有很大的改善，该技术主要用于中药多糖基团结构和糖苷键连接方式的分析。

2. 2. 2. 2核磁共振波谱法(NMＲ)
NMＲ是利用磁场作用检测分子中原子核性质及其与周围化学环境的相互作用而实现结构分析。该技术不破坏多糖样品，可准确反映多糖的整体真实结构，是目前中药多糖结构分析的主要技术。随着高磁场技术的发展，NMＲ可分为1H－NMＲ、13C－NMＲ和二维NMＲ谱(2D－NMＲ)。这些技术可提供单糖残基的类型，各糖残基中 C、H 化学位移归属，各糖残基间的连接位置和连接顺序等结构信息。

2. 2. 2. 3高分辨质谱法(HＲMS)
随着质谱技术的发展，HＲMS 技术在中药多糖的结构解析中显示出巨大的发展潜力。HＲMS 具有灵敏度高、分辨率高、扫描速度快等特点，可为中药未知多糖提供精确的分子质量及相关结构信息。目前，HＲMS 主要有飞行时间质谱(TOF)、静电场轨道阱(Orbitrap)等应用于中药多糖的结构分析。另外，HＲMS可结合其他检测技术实现更多维的中药多糖结构解析。
 

3 结论与展望
目前由于中药多糖种类繁多、结构复杂，研究尚不充分，上述的中药多糖前处理以及检测方法为中药多糖的含量测定、多糖的单糖组成分析、多糖分子量以及结构分析提供了参考。目前，寻找一种环保、成本低、提取效率高的前处理技术是中药多糖成分的重要内容之一，而高压脉冲电场辅助提取法、动态高压微射流辅助提取法、加速溶剂萃取法和超临界流体萃取法是近年来用于提取中药多糖成分的新兴技术。相比于传统技术，新型技术具有绿色污染低、提取效率高等特点。此外，越来越多的学者逐步挖掘 HPLC －HＲMS 及其相关联用技术用于中药多糖检测。该方法能够提供中药多糖的Mw、数均分子量、分子量分布、多糖成分单元结构、多糖的单糖组成以及含量等重要信息，所测数据准确、可靠，在中药多糖的表征方面具有很好的应用潜力，将有助于中药多糖成分的进一步开发利用。