植物硝酸还原酶（NR）的代谢途径、功能及其活性测定方法

硝酸还原酶（Nitrate Reductase，简称 NR）是高等植物氮素同化的限速酶，可直接调节硝酸盐还原，从而调节氮代谢，并影响到光合碳代谢。

一、硝酸还原酶代谢途径

硝酸盐被特异性的硝酸盐转运蛋白(硝酸还原酶T)高效运输到植物根细胞中，储存在液泡里，在细胞质中被硝酸还原酶降解成亚硝酸盐。亚硝酸盐进入根的叶绿体或非绿色组织的质体中，在6-铁氧还蛋白的帮助下亚硝酸还原酶将其进一步还原成铵。细胞中发生的从硝酸盐到铵的降解过程分为两步，第一步是硝酸还原酶将硝酸盐降解成亚硝酸盐;第二步为亚硝酸还原酶将亚硝酸盐降解成铵。随后在ATP供能下，谷氨酰胺合成酶(GS)将谷氨酸和NH+4转换成谷氨酰胺，该过程是在叶绿体、细胞质或根细胞质体中进行的，最终铵参与到氨基酸的合成。谷氨酸合成酶(GOGAT)可将谷氨酰胺和α-酮戊二酸转换为两分子的谷氨酸。谷氨酸合成酶有NADH-GOGAT和Fd-GOGAT两种类型，前者主要存在于高等植物的光合细胞中，以NADH为电子供体，活性较高;后者在高等植物光合细胞和非光合细胞中均存在，以还原态的铁氧还蛋白为电子供体，活性较低。

此外，当植物细胞中NH+4浓度较高时，NADH提供电子，NH+4还可以由存在于叶绿体和线粒体中的谷氨酸脱氢酶还原为谷氨酸。但谷氨酸脱氢酶与NH+4的亲和度较低。有些氨基酸是在转氨酶的参与下由谷氨酸和酮酸参与形成的。氨基酸构成蛋白质和各种含氮化合物，也是次生化合物的起点。这里的所有酶和反应被称为硝酸盐同化途径。

二、硝酸还原酶功能

2.1 NR与有机酸积累之间的关系
      硝是大部分植物氮素的主要来源。硝的添加使硝吸收增加，并提高了NR、GS、GOGAT的活性。同时在C代谢中也有一些重要的变化，如淀粉含量下降及有机酸的合成。这些能为氨基酸合成提供C骨架，并且能调节pH防止碱化。整株植物的发育和分配也受到硝的调控，对植株根的特定部位施加硝会刺激侧根的生长，高硝浓度会促进地上部的生长而抑制根的生长，并延迟开花和衰老。在NR的活体测定体系中添加苹果酸时会使硝还原提高，苹果酸氧化来为硝还原提供NADH。曾有人提出，苹果酸（直接地）和CO2（间接地通过苹果酸）可以调控植物中的硝水平。硝最初是由根的表皮和皮层细胞穿过细胞膜而被根部吸收，后来的转运是由叶和维管系统中的液泡膜和质膜来进行的，从液泡中运出的NO3-可能参与苹果酸的可逆转换，硝的还原和苹果酸的产生之间有着密切的关系。

在硝酸盐同化期间，a-氧化型谷胱甘肽作为铵的受体在GOGAT途径中发挥作用，苹果酸和柠檬酸作为阴离子的对抗物以取代硝酸盐并防止碱性化。苹果酸是在PEP途径中由PEPcase合成的，柠檬酸是由PEPcase、丙酮酸激酶、丙酮酸脱氢酶和柠檬酸合酶协同合成的。由异柠檬酸向a-氧化型谷胱甘肽的转变发生在胞质中，由NADP-ICDH脱氢酶催化，NO3-作为一种信号去诱导有机酸的合成。

2.2 NR与NO及其植物抗逆性的关系

在测定大豆叶片硝酸还原酶活性时就发现，不依赖于氧气的 NOx(NO+NO2)酶促产生现象，进一步的突变体实验初步证实其与组成型硝酸还原酶中的C1NR类型有关。玉米诱导型硝酸还原酶具有以NADH作为电子供体，催化亚硝酸盐的单电子还原合成NO的能力，而一氧化氮（NO）能影响植物的生长、发育、衰老和抗病等生理代谢过程，如诱导气孔关闭、促进种子萌发、幼苗去黄化以及抑制下胚轴延伸等光形态建成；缓解各种胁迫下的活性氧伤害；并作为第二信使激活各种抗病防卫基因的表达。

NO可以诱导植物叶片保卫细胞的气孔关闭来降低干旱胁迫下的蒸腾作用，并可能与 ABA水平的调节有关。NO在调节植物气孔运动的过程中，一方面可以作为ABA的下游信号分子诱导依赖于ABA的气孔关闭；另一方面NO可以和H2O2协同诱导气孔关闭。考虑到ABA不仅可以作为植物胞间信号物质介导植株整体的抗逆反应，也能作为细胞逆境信号物质直接介导许多抗逆基因的表达，NO可能是通过诱导ABA的积累影响植物的干旱响应的。因此，进一步了解植物NR催化亚硝酸盐单电子还原生成 NO 的调控机制及其和内源NO在植物逆境响应中的作用，为有效缓解各种胁迫的氧化伤害提供新的思路。
三、硝酸还原酶活性测定方法

3.1原理

硝酸还原酶是植物氮素同化的关键酶,也是一种诱导酶，与作物吸收和利用氮肥有关,可催化硝酸盐还原为亚硝酸盐；产生的NO2-在酸性条件下可以与对氨基苯磺酸(sulfanilic acid)或磺胺(对氨基苯磺酰胺,sulfanil-amide)反应生成重氮盐,再与α-萘胺反应生成红色偶氮化合物(对苯磺酸偶氮-α-萘胺)。生成的红色偶氮化合物在520 nm波长下有最大吸收值,可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可以每小时每克鲜重产生的NO2- μg 数表示酶活性(NO2- μg·g-1FW·h-1)。

3.2 方法步骤                                  

（1）标准曲线制作：取7支15mL 刻度试管，按顺序添加试剂。

（2）取新鲜植物组织洗净，拭干。如果是叶片可去主脉，打成直径1cm的圆片，若是根、茎可切成0.1cm厚的薄片。

（3）取上述材料4份，每份50片，称重后分别放入4个50mL三角瓶中，其中1个为空白，3个用于酶活性测定，分别记为重复1、2、3。

（4）在空白瓶中先加1mL 30%三氯乙酸，然后在每个三角瓶中加入0.1 mol·L-1 pH 7.5 磷酸缓冲液5mL、蒸馏水5mL（内源基质法）。如果是外源基质法，则将蒸馏水换为5mL 0.2 mol·L-1 KNO3。

（5）将三角瓶置于真空干燥器中抽气至样品完全沉入溶液中（约10min）。

（6）取出三角瓶，30℃避光30min；之后在重复中也分别加入1mL 30%的三氯乙酸以终止反应，摇匀。

（7）吸取2mL（若反应液浓度太大，可吸取1mL 加 1mL水）反应液于10mL试管中，加磺胺试剂2mL，α-萘胺试剂2mL，静置30min；比色，记下吸光度（A），从而计算出酶活性值。