水杨酸的生物合成和含量测定

植物激素水杨酸(salicylic acid，SA)是广泛存在于植物体中的小分子酚类物质，参与植物多种生理过程，特别是在植物免疫中发挥重要功能。SA参与植物生长发育的多个过程，并在植物对环境胁迫响应中发挥重要功能。SA调控植物种子萌发、出芽、开花、坐果和果实成熟等过程，SA介导植物对非生物胁迫的抗性，SA能改变植物对重金属、热、冷、干旱、高盐等胁迫环境的适应性，最新研究表明，SA通过抑制乙烯信号途径影响植物出芽过程中顶端弯钩的形成。

一、 水杨酸的生物合成

植物通过两条通路合成水杨酸：异分支酸合酶（ICS）途径和苯丙氨酸解氨酶（PAL）途径，它们都起始于叶绿体，以分支酸为前体，并涉及多个酶促反应，两条途径对SA合成的贡献存在差异。

1、ICS 途径

在叶绿体中，分支酸(chorismic acid, CA ) 首先在异分支酸合酶 (ICS1) 的催化下形成异分支酸(ISC)，异分支酸生成后只需两种蛋白即可生成SA，分别为EDS5和PBS3。EDS5的功能是把异分支酸从质体转运到细胞质。PBS3是一种氨基转移酶，在它的催化作用下，异分支酸和谷氨酸生成异分支酸-谷氨酸加合物(ISC-9-Glu)，后者非常不稳定，可自发分解生成SA。因此，PBS3是植物SA生物合成途径中缺少的关键酶。

2、PAL途径

通过同位素标记实验发现在烟草中苯丙氨酸(Phe)可以经反式肉桂酸(t-CA)、苯甲酸(benzoic acid)进而合成 SA。已知 PAL 和 AIM (abnormal inflorescence meristem 1)分别是催化合成反式肉桂酸和苯甲酸的关键酶类，而苯甲酸可能被 BA2H(benzoic acid 2-hydroxylase)羟基化产生 SA，但在植物体内编码 BA2H 的基因尚未被解析。
 

二、 水杨酸的生物合成

1、测定原理

试样中水杨酸用甲醇进行提取，以甲醇-乙酸水溶液为流动相，在选定的工作条件下，用高效液相色谱仪测定，外标法定量。

2、试样提取

称取试样1g加入 １０ ｍＬ 预冷的 ８０％ 甲醇，冰浴研磨成浆，保鲜膜密封后于４ ℃ 冷浸过夜。然后于４ ℃ 条件下以 ８000ｒ/ ｍｉｎ 离心 １0 ｍｉｎ 得上清液，残渣加入8ｍＬ ８０％ 的冷甲醇离心 １0ｍｉｎ 后合 并上清液。全部滤液于 ４0℃ 下减压浓缩至原体积 的 １/３，加入３0 ｍＬ 石油醚萃取脱色３次，弃醚相。水相用２0 ｍＬ 乙酸乙酯萃取3次，合并酯相，40℃下减压蒸干，加入pH3.5的乙酸溶液２ｍＬ,过Sep-Pak Ｃ18小柱纯化,用甲醇洗脱,收集后在40℃下减压浓缩至干,用流动相溶解并定容至２ｍＬ,经 0.45μｍ 微孔滤膜过滤后待测。

3、色谱条件

色谱柱：C18柱，250 mm×4.6 mm，5μｍ；流动相：甲醇：乙酸水溶液（pH3.6）=28：72；流速：1.0 mL/min；柱温：30°C；检测波长：240nm；进样体积：10μL；

4、标准曲线的绘制

移取水杨酸标准溶液（1 000 mg/L）0.10 mL、0.20 mL、0.50 mL、0.80mL、1.00 mL和2.00 mL至10 mL容量瓶中，甲醇定容，配制成浓度为10 mg/L、20 mg/L、50 mg/L、80 mg/L、100 mg/L、200 mg/L的标准工作溶液。按照色谱条件浓度由低到高的顺序进行测定，以色谱峰峰面积为纵坐标，对应的浓度为横坐标，绘制标准工作曲线。

5、试样测定

取适量待测溶液，按照色谱条件进行测定，外标法定量。

6、结果计算

试样中水杨酸的含量W按下式计算。

W=(C1-C0)*V/m/1000

  式中：

C1——由标准曲线查得试样溶液中水杨酸的浓度，单位为毫克每升（mg/L）；

C0——由标准曲线查得空白溶液中水杨酸的浓度，单位为毫克每升（mg/L）；

 V——样品的定容体积，单位为升（mL）；

 m——样品质量，单位为克（g）。